A triagem funcional genotipada de clones Fab solúveis permite

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13107 (2023) Citar este artigo

303 Acessos

1 Altmétrico

Detalhes das métricas

Anticorpos monoclonais (mAbs) e seus fragmentos são amplamente utilizados em terapêutica, diagnóstico e pesquisa básica. Embora os métodos de exibição, como a exibição em fagos, ofereçam alto rendimento, as afinidades dos anticorpos individuais precisam ser medidas com precisão em formato solúvel. Desenvolvemos uma plataforma de triagem capaz de fornecer dados funcionais genotipados de um total de 9.216 clones solúveis de fragmentos de ligação ao antígeno individuais (Fab), empregando sequenciamento de próxima geração (NGS) com indexação hierárquica. Sequências completas de domínio variável emparelhadas (VL-VH) estão ligadas a dados de triagem funcional, permitindo uma análise aprofundada dos efeitos da mutação. A plataforma foi aplicada a quatro projetos de triagem scFv/Fab selecionados por exibição de fagos e um projeto de maturação de afinidade VH de saturação de local. A triagem funcional genotipada permitiu simultaneamente a identificação de mutações que melhoram a afinidade no domínio VH do Fab 49A3, reconhecendo a proteína não estrutural 1 (NS1) do sorotipo 2 do vírus Dengue e informando sobre as posições dos resíduos VH que não podem ser alteradas do tipo selvagem sem diminuir a afinidade. A identificação baseada em genótipos revelou-nos a extensão da variação do sinal intraclonal inerente aos dados de triagem de ponto único, um fenômeno frequentemente negligenciado no campo. Além disso, a triagem genotipada eliminou a seleção redundante de genótipos idênticos para estudos adicionais e forneceu uma nova ferramenta de análise para avaliar o sucesso das seleções de exibição de fagos e a diversidade clonal remanescente nos repertórios selecionados.

A engenharia de anticorpos recombinantes é uma história de sucesso no campo da biotecnologia. Anticorpos monoclonais (mAbs) e seus fragmentos, como o fragmento variável de cadeia única (scFv) e o fragmento de ligação ao antígeno (Fab), são amplamente utilizados na terapêutica, no diagnóstico e como ferramentas para pesquisa básica1. À medida que novas moléculas alvo para estas aplicações são descobertas, são necessários ligantes novos ou melhorados com elevada afinidade, especificidade e propriedades físico-químicas desejadas.

O tamanho menor dos fragmentos de anticorpos e a falta do domínio Fc oferecem vários benefícios em comparação com IgG de tamanho normal, incluindo melhor penetração nos tecidos2,3 e menor chance de interferência em ensaios de diagnóstico in vitro4. Do ponto de vista da engenharia de anticorpos, a principal vantagem da estrutura simples dos fragmentos de anticorpos é a sua expressão económica e fácil em E. coli, permitindo a sua utilização em phage display5. Tecnologias avançadas de biblioteca genética de anticorpos recombinantes6,7 combinadas com métodos de exibição de alto rendimento oferecem uma maneira eficiente de enriquecer ligantes contra uma vasta variedade de alvos8.

Embora os métodos de exibição tenham alto rendimento, a afinidade e a especificidade dos ligantes individuais precisam ser avaliadas através da triagem de um grande número de anticorpos individuais em formato solúvel. A perda de especificidade foi relatada em alguns estudos após fragmentos de anticorpos exibidos em fagos terem sido convertidos em formato solúvel9,10. Isto poderia ser explicado pela conformação alterada do scFv após perder o suporte da proteína pIII, que é o parceiro de fusão mais comum do scFv para exibição. Há também relatos de perda de afinidade após conversão direta do formato scFv para IgG11,12, limitando bastante as áreas de aplicação dos anticorpos descobertos. Além disso, a multimerização não intencional de scFvs leva a uma ligação mais forte através de efeitos de avidez, o que não é desejado na triagem ou na triagem solúvel13,14. Os Fabs, no entanto, são geralmente considerados moléculas monoméricas, que é o formato de triagem ideal para ensaios de afinidade e, embora a existência de partículas fágicas com múltiplos Fabs exibidos não possa ser descartada, o risco de enriquecimento devido a efeitos de avidez é menor com Fab do que com scFv. bibliotecas de fagos13. Além da estimativa confiável de afinidade, a triagem solúvel permite a identificação de clones com bons níveis de expressão.

3) among the phage display selected libraries. Among genotypes encountered at least three times in the screening campaign, 66.7% did not bind to the SpyCatcher-antigen (S/B < 3), whereas, of the remaining genotypes, 28.9% showed S/B-ratio both above and below the set threefold threshold ratio, and 4.4 % were positive (S/B > 3) in all instances (6.7% if calculated by S/B > 2). On the contrary, anti-DARPin library was over enriched in relation to the number of clones screened, with only 76 unique genotypes, 43% of which were represented between 2 and 331 times with a standard deviation (SD) of 47. Three genotypes, including one used as control, were present with 170 clones or more. The low number of unique clones in the anti-DARPin Fab repertoire is consistent with the selection scheme, as four rounds of Fab-phage selections were carried out with the anti-DARPin library in contrast to three with anti-SpyC library and one to two with anti-NP libraries. The genotype copy numbers per library are shown in Fig. 2b./p> 3) and distribution of functional screening data differed between the phage-derived screening projects. Despite undergoing 4 + 4 rounds of phage display, it appears that the anti-SpyCatcher library was not fully enriched and could have potentially benefited from an additional round of phage display selection or a reconsideration of the selection strategy. The selection campaign involved various antigens, including chemically biotinylated SpyCatcher, scFv-SpyCatcher, and in vivo biotinylated Spy- and SdyCatcher proteins, aiming to enhance binding towards the catcher rather than the SA-biotin linker. The insufficient enrichment is evidenced by the low number of identical genotypes in the screened set and a relatively low hit rate of 13%. Low hit rate can also be seen in the distribution of the functional signal data (Fig. 2), which is heavily bottom weighted. In the remaining three projects, the hit rates were higher and also the shared genotypes more abundant. In the case of the anti-DARPin library the selection could have been screened after the 3rd round instead of the 4th round of panning, as only a few genotypes were represented in the data, which also had a quite evenly distributed functional signal. NP-1 and NP-2 both come from the same Fab-converted phage library origin, but the functional data between them is very different, with NP-2 having more evenly distributed signals between clones. This was expected, as the last two selection rounds and assay formats were different. NP-2 Fabs were first bound on the wells, followed by addition of biotinylated antigen and detected with Eu-labeled streptavidin, whereas NP-1 Fabs were selected to bind antigen captured by the control Fab N1G1, and the presence of E. coli-expressed Fab-APs was detected with europium-labeled anti-alkaline phosphatase antibody./p>